Автор: kutlyewa

Сейчас их принято разделять на архимицетов и фикомицетов, но граница этого деления проводится разными авторами различно. Согласно взглядам Гоби, развитым затем главным образом Сербиновым (1907), Myxochytridiales стоят особняком среди других грибов по целому ряду признаков (отсутствие мицелия, вегетативное состояние в виде голой амебообразной массы) и имеют совершенно самостоятельное происхождение. Эти взгляды приняты и в современном руководстве Геймана (1925), где Myxochytridiales и выделяются в качестве класса Archimycetes, имеющего свои корни среди Flagellata, тогда как другие низшие грибы (в том числе и Mycochytridiales) берут начало от зеленых водорослей. Другие авторы не решаются таким коренным образом раскалывать группу хитридиевых, которая все-таки имеет ряд общих черт (например очень характерно построенные одножгутиковые зооспоры, свойственные большинству их), и поэтому выделяют в качестве примитивных грибов (архимицетов) вместе с Myxochytridiales также и Mycochytridiales. Так это проводится, например, в другом современном руководстве Gwynne Vaughan (1927). Пожалуй, такое разделение нужно признать более целесообразным при современном уровне наших сведений, так как при этом подчеркивается только примитивная организация архимицетов и оставляется в стороне вопрос об их особом происхождении. Остальные низшие грибы, или фикомицеты, характеризуются типично развитым неклеточным мицелием. Из них оомицеты в лице своих наиболее известных представителей напоминают Siphonales из зеленых водорослей. Однако встает вопрос, является ли это сходство результатом филогенетической близости или зависит больше от сходных условий существования (конвергенция). Можно думать, что правильнее последнее и что оомицеты представляют прогрессивную ветвь, берущую начало от архимицетов. Это тем более делается сейчас вероятным, что среди Blastocladiaceae мы имеем до некоторой степени переходные формы между этими группами. Подобно архимицетам и оомицеты являются еще в основе своей водными организмами. Только большинство Реrоnоsрorаlеs перешло на наземное существование. Эту группу и рассматривают как наиболее эволюционировавшую среди оомицетов. Вторая большая группа фикомицетов, зигомицеты, всецело эволюционировала в сторону приспособления к наземному существованию. Многие авторы выводят их в качестве второй прогрессивной ветви из архимицетов. При этих представлениях отсутствие у зигомицетов подвижных органов размножения нужно рассматривать как вторичное явление, выработавшееся в соответствии с условиями существования. Однако существует и другое мнение, по которому отсутствие зооспор у зигомицетов представляет первичное явление ввиду того, что данная группа происходит от организмов, которые уже сами по себе не имели жгутиковых стадий (вроде современных Conjugatae среди водорослей). Это второе представление кажется нам менее обоснованным.

Стоящие здесь вопросы принадлежат к наиболее теоретическим вопросам микологии, где приходится основываться в значительной степени на предположениях и где поэтому нет и, пожалуй, не может быть сейчас единообразных решений. Ввиду этого здесь целесообразно вкратце осветить сначала основные точки зрения, какие имеются на этот предмет.

Прежде всего необходимо отметить большое разнообразие мнений, какое существует по основным вопросам — о происхождении грибов. Здесь нет единогласия ни относительно того, с какими другими растениями они находятся в родстве, ни относительно того, являются ли грибы единой по происхождению группой или отдельные группы их произошли независимо от разных корней, т. е. монофилетично или полифилетично их происхождению.

Основатели современной микологии, де-Баои и Брефельд, стояли на точке зрения монофилетизма грибов и выводили их из зеленых водорослей, специально Siphonales, с которыми у многих простейших представителей действительно имеются значительные черты сходства в строении и размножении. Эти взгляды являются, пожалуй, и сейчас наиболее распространенными в широких ботанических кругах. Они находят отражение и в самом названии низших грибов — фикомицеты, или грибы-водоросли, т. е. группа в известной мере переходная между этими двумя типами растений. Вместе с тем эти представления заставляют видеть в отсутствии у грибов хлорофилла вторичный признак — результат утраты пигмента бывшего у их предков. Наконец, так как с водорослями (из сифоновых) наиболее сходны такие группы оомицетов с хорошо развитым неклеточным мицелием как Saprolegniales или Peronosporales, то они и должны ставиться в основание ряда грибов. В то же время более просто организованные Chytridiales де-Бари и Брефельд рассматривают как вторично упрощенные в связи с их большею частью паразитным существованием.

Иные взгляды развивает Данжар (1886) и ряд русских ученых, как Гоби (1916) и Ячевский (1927). Они стоят тоже на точке зрения монофилетизма грибов, однако выводят их не из водораслей, а в качестве самостоятельного и параллельного им ряда из низших жгутиковых или подобных им протистов. При этом последние могли быть и не зелеными, так что отсутствие хлорофилла у грибов возможно мыслить и как первичное свойство. Согласно этим представлениям меняется и положение хитридиевых: они рассматриваются как наиболее примитивная группа, из которой эволюционировали более высоко стоящие.

Если приведенные мнения характеризуются тем, что исходят из представления о монофилетическом происхождении грибов, то существует и другое течение, защищающее их полифилетичность. На этой точке зрения стояли еще такие современники де-Бари и Брефельда, как Кон (1872) и Сакс (1870). Последний, например, выводил оомицеты из сифоновых водорослей, зигомицеты — из конъюгат, дрожжи — из протококковых, другие аскомицеты из Goleochaete, ржавчинные — из красных водорослей, а другие базидиомицеты — из харовых.

Позднее, в конце XIX и в начале XX в., под влиянием новых добытых фактов (и одностороннего их истолкования) мнение о полифилетизме грибов получило особо широкое признание и сделалось даже преобладающим. Его крайнее выражение можно видеть, например, в известном компендиуме Lotsy (1907), где по существу грибов как целого не существует, а все распылено по отдельным боковым ветвям, отходящим от разных групп водорослей. Однако даже и более умеренные полифилетисты обыкновенно резко различают происхождение низших и высших грибов. Первые связываются с зелеными водорослями, а вторые — с багряными. Эта последняя связь особенно отмечается для аскомицетов, а также некоторыми и для ржавчинников.

Однако современное состояние микологических знаний опять заставляет, повидимому, возвращаться к монофилетичности у грибов, в крайнем случае к монофилетичности огромного большинства их, допуская, может быть, иное происхождение для некоторых простейших форм (Myxochytridiales). Всего вероятнее, что грибы берут свое начало от простейших организмов, близких к бесцветным жгутиковым.

Что касается дальнейшей эволюции грибов и родственных отношений между ныне существующими группами их, то и эти- вопросы далеко не выяснены. Палеонтологические данные здесь, к сожалению, не дают никаких руководящих нитей, так как ископаемые остатки грибов слишком скудны, и хотя известны еще с девонского периода, но большею частью в виде стерильного мицелия или во всяком случае в таком состоянии, которое не дает ясного представления об их организации. Правда, из третичного периода известны и плодовые тела, но это главным образом формы трутовиков, весьма близкие к современным. Вообще на основании палеонтологии можно сделать только заключение о большой древности грибов. Поэтому здесь приходится делать все выводы исключительно на основании сравнения ныне живущих форм. Однако этот метод здесь особенно ненадежен, так как у грибов, может быть, больше чем во всякой другой группе растений играют роль явления упрощения, регресса в связи с их особыми условиями существования. Поэтому здесь особенно трудно отличить первично простое от вторично упрощенного.

Все эти принципиальные затруднения в полной мере сказались в том разнообразии взглядов, какие существуют в филогенетической систематике грибов.

Относительно основного пути эволюции грибов существовало, как известно, две противоположные точки зрения. По мнению де-Бари, здесь в основе лежит половое воспроизведение, имеющееся не только у низших, но и у высших грибов (специально констатировано им у сумчатых), тогда как, согласно учению Брефельда, грибы представляют бесполый ряд организмов, и их эволюция только сказывается на органах бесполого размножения, выражаясь в основе в том, что спорангий и конидиеносец низших грибов, получая более постоянную форму и фиксируя число спор, превращаются соответственно в сумку и базидию высших. Это разногласие может считаться окончательно решенным в пользу взглядов де-Бари с значительным расширением их в том смысле, что сумка и базидия не только гомологичны друг другу, но и представляют органы по существу полового воспроизведения, а не просто усовершенствованные спорангии и конидиеносцы, как это утверждал Брефельд. Таким образом, характер полового воспроизведения кладется сейчас всеми авторами, в основу филогенетической систематики грибов. Тем не менее в подробностях имеется большое различие мнений.

Микроскопическое исследование грибов в основе представляет мало особенностей по сравнению с другими растительными объектами. Культуры на прозрачной среде, налитой тонким слоем в чашках Петри, могут прямо просматриваться под микроскопом при слабом увеличении. Еще удобнее вырезать кусочек среды вместе с грибом и рассматривать его на предметном стекле. Если нужен боковой вид, то его можно легко получить, отрезав соответственный узкий ломоть среды и положив на стекло боком. При этих условиях большая часть органов размножения рассматривается непосредственно на месте их образования в воздушной среде. Это имеет и преимущества, так как при этом конидиеносцы и т. п. сохраняют свой естественный вид и споры, но вместе с тем и известные недостатки, так как заставляет пользоваться только слабым увеличением, а самое изображение объекта, находящееся в воздухе, много теряет в своей ясности. При более сильных увеличениях, когда необходимо покровное стекло, рекомендуется помещать объект не в воду, а в крепкую уксусную кислоту, которая прекрасно смачивает его (например трудно смачиваемые, иначе, конидиеносцы с конидиями) и удаляет из него воздух. Вместе с тем уксусная кислота значительно меньше деформирует объект и не вызывает отпадения конидий, чем выгодно отличается от часто употребляемого также для этих целей спирта. Если гриб находится на непрозрачном субстрате или сам он слишком массивен и поэтому непрозрачен, то, конечно, необходимы срезы, которые затем в случае нужды могут просветляться (едким кали, лактофенолом и т. д.). В других случаях хорошие результаты дает просто соскабливание с поверхности субстрата. При изучении мелких сочных плодовых тел очень хорошие результаты нередко дают раздавленные препараты: все плодовое тело или, лучше, толстоватый ломтик, вырезанный из его середины, раздавливается в капле воды между предметным и покровным стеклами. Таким образом, например, у Ascobolaceae легко удается получить хорошие картины аскогенных гиф с сидящими на них асками на разных стадиях развития. Если раздавливание произвести в капле фиксирующей жидкости, то препарат затем можно пустить и на окраску ядер, например гематоксином Делафильда (промывать не снимая покровного стекла). Постоянные препараты, сделанные таким простым способом, лучше заключать в глицерин, так как при перенесении в канадский бальзам они слишком деформируются, а неокрашенные, кроме того, делаются слишком прозрачными до исчезновения некоторых контуров.

Способы диференцированной окраски

Для изучения прохождения гиф паразита в ткани питающего растения предложено несколько иногда довольно сложных способов диференцированной окраски их. По нашему опыту очень хорошие результаты дает следующий метод: срезы от руки опускаются на несколько минут в спирт (если изучается не фиксированный материал), и затем после ополаскивания в воде помещаются в раствор следующего состава: Anilinblau (0,1% водный раствор) — 1 часть и молочная кислота — 1 часть. В нем срезы нагреваются на предметном стекле несколько минут до парообразования. Затем после удаления краски они диференцируются при нагревании в одной молочной кислоте. Получаются яркоголубые гифы на бесцветном фоне ткани хозяина. Препараты, изготовленные таким образом, могут сохраняться, не теряя окраски, в молочной кислоте несколько дней и даже недель; если же, удалив молочную кислоту, заключить их в глицерин или бальзам, то получаются постоянные препараты.

Для целей более тонкого цитологического исследования необходима, конечно, более сложная методика. Прежде всего фиксация. Общие правила ее таковы:

1. Фиксируемый материал должен быть свежим и тургесцентным. Если берется материал из природы, то его лучше фиксировать на месте, или, принеся домой, поставить на ночь в условия большой влажности (например ветви или листья с паразитными грибами опустить черешками в воду и все накрыть стеклянным колпаком). То же нужно делать при сборе материала в жаркую засушливую погоду или во время значительных понижений температуры. В теплом и влажном помещении в комнате не только восстанавливается туpгop, но и возобновляются митозы, которые при неблагоприятных условиях прекращаются. Дневные и ночные фиксации по нашим наблюдениям в общем не отличаются по обилию ядерных делений.
2. Фиксирующая жидкость должна быстро проникать в фиксируемый материал; для этого вообще нужно фиксировать небольшие кусочки (несколько миллиметров). Если фиксируются листья, особенно водными жидкостями, плохо смачивающими их эпидермис, то из них вырезаются кусочки, содержащие гриб, и жидкость проникает в ткань через разрезы листовой сочной мякоти (кусочки следует потопить, например, металлической пропарафиненной селкой). Иногда для особо трудно смачиваемых объектов хорошо погрузить их сначала на несколько секунд в 70% спирт и из него уже перенести в водную фиксирующую жидкость. Прониканию жидкости внутрь объекта очень помогает фиксация при пониженном давлении под колоколом насоса (существенное преимущество фиксации в лаборатории перед фиксацией на месте сбора). При этом объекты, плавающие на поверхности жидкости, следует потопить. Когда из них при уменьшении давления выйдут пузырьки воздуха, кран колокола слегка приоткрывается и повышающееся давление загоняет фиксирующую жидкость внутрь объекта. Фиксация культур под насосом производится таким же образом вместе с вырезанными кусочками питательной среды (агар может затем заливаться в парафин, а желатину необходимо отмыть перед заливкой теплой водой, причем после хромовых фиксаций отмывание идет плохо).

Фиксирующие жидкости

Наиболее употребительные в микологической практике фиксирующие жидкости делятся на две основные категории: спиртовые и водные. Преимущество первых в том, что они хорошо смачивают объект и быстро в него проникают, с другой стороны, они часто вызывают значительные деформации и сжимания, особенно клеток с большими вакуолями. Водные жидкости хуже смачивают и проникают, но их действие на клетки более нежное и постепенное; поэтому таких деформаций они обыкновенно не дают.

Спиртовые жидкости:
1) Жидкость Саrnоу имеется в нескольких видоизменениях:

а) Абсолютного спирта — 3 части, Ледяной уксусной кислоты — 1 часть;
b) Абсолютного спират 6 частей, Ледяной уксусной кислоты — 1 часть, Хлороформа — 3 части;
с) Видоизменение Maire: Абсолютного спират — 1 часть, Уксусной кислоты — 1 часть, Хлороформа — 1 часть, Сулеймы — до насыщения.

Все преимущества и недостатки спиртовых жидкостей выражены здесь наиболее резко. В общем хорошая фиксация ядер, особенно в клетках с обильной протоплазмой. Прибавление сулемы (по рецепту Мэра) способствует, по нашим наблюдениям, более четким окраскам ядер и их митозов.

2) Жидкость Juel:
Хлористого цинка — 2г
50% спирта — 100 куб. см
Уксусной кислоты — 2 куб. см

Меньше сжимает, чем жидкость Саrnоу, но фиксация ядер часто менее четкая.

3) Жидкость Schaudinn:
Абсолютного спирта — 100 куб. см
Насыщенного водного раствора сулеймы — 200 куб. см
Уксусной кислоты — 2 куб. см

4) Спирт абсолютный, или 96°, или спирт с формалином состава: 70% спирта 94—98 частей + формалина 6—2 части. Пригодны преимущественно для анатомических целей, а крепкий чистый спирт также и для цитологических, хотя клетки с значительными вакуолями им сильно сжимаются. Преимущество этих жидкостей в том, что объекты в них могут и сохраняться (для длительных экскурсий).

Водные жидкости:
5) Жидкость Flemming. Чаще употребляют так называемую слабую смесь.
1% хромовой кислоты — 180 куб. см
2% осмиевой кислоты — 25 куб. см
Уксусной кислоты — 12 куб. см
Дестиллированной воды — 210 куб. см

Осмиеву кислоту можно также прибавлять не в растворе, а в кристаллах, делая по ее количеству расчет всех других ингредиентов. Классическая фиксирующая жидкость, превосходно фиксирующая ядра. Недостаток — медленное проникание, поэтому рекомендуется особенно для мелких объектов или хорошо смачиваемых (например кусочков сочных плодовых тел).

6) Видоизменение Навашина с заменой осмиевой кислоты формалином.
1% хромовой кислоты — 15 куб. см
Формалина — 2 куб. см
Уксусной кислоты — 1 куб. см
Дестиллированной воды — 17 куб. см

Формалин прибавляется перед употреблением. На высших растениях дает очень хорошие результаты. По нашему небольшому опыту работы с этой жидкостью для некоторых грибов она также пригодна, хотя в общем значительно хуже Флемминга.

7) Жидкость Merkel.
1% хромовой кислоты — 1 часть
1% хлористой платины — 1 часть
Дестиллированной воды — 1 часть

Приближается по характеру фиксации к Флеммингу, но не чернит объекта. Рекомендуется особенно для молодых стадий развития: аскогоны и т. п.

8) Хромово-уксусная кислота:
Хромового ангидрида — 7г
Уксусной кислоты — 3г
Воды — 100 куб. см

Особенно для водных форм (сапролегниевые и другие), где дает превосходную фиксацию.

9) Пикрсформол:
Формалин (40%) — 6 частей
Вода — 4 части
Уксусная кислота — 1 часть

Прибавляется до насыщения пикриновой кислоты.

Пикроформол особенно рекомендуется Maire для гименомицетов. По нашему опыту с Uredinales и некоторыми аскомицетами фиксация ядер получается не вполне удовлетворительная.

10) Сулема с уксусной кислотой:
Сулема — 10 г
Уксусная кислота — 3 куб. см
Вода — 300 куб. см

Кроме указанного, существует еще много рецептов водных сулемовых фиксаторов (жидкость Ценкера и др.). Все они имеют более или менее одинаковые достоинства. Фиксация ядер четкая. По нашим наблюдениям сулема (также и в комбинации Schaudinn) дает хорошие результаты у Ustilaginales (прорастание хламидоспор, споридии и т. д.).

Кроме перечисленных, употребляются еще иногда и другие фиксаторы, перечислять которые здесь не нужно. Вообще следует сказать, что выбор фиксатора зависит в первую очередь от объекта, и при работе с незнакомым объектом приходится обыкновенно фиксировать его параллельно несколькими методами.

Продолжительность фиксации зависит от фиксатора и от объекта, чаще всего 12—24 часа. После фиксации фиксирующая жидкость отмывается тщательно водой (для сулемовых фиксаторов — водой или разведенным спиртом с добавкой йода до цвета белого вина). Затем объекты сохраняются в 70% спирту, куда переносятся из воды через 2—3 степени более слабых разведений спирта.

Дальнейшая обработка фиксированного материала: обезвоживание, заключение в парафин и т. д. производится по обычным правилам микроскопической техники, поэтому здесь на этом можно совсем не останавливаться. Можно отметить только, что объекты, зафиксированные с агаром, с ним вместе заливаются в парафин и режутся на микротоме. Это представляет даже значительное преимущество для ориентировки мелких объектов, например, зачатков плодовых тел, или конидиеносцев, которые сидят обыкновенно перпендикулярно к поверхности питательного агара. Способность агара резаться на микротоме используется и для заливки очень мелких свободных объектов. Они помещаются на поверхности плоской застывшей капли 2% агара, на предметном стекле, расправляются и ориентируются там под лупой и затем накрываются второй каплей растопленного агара или лепешечкой уже застывшего (избегать пузырьков воздуха). В последнем случае затем горячей иглой по краям обе лепешечки сплавляются. Затем все снимается со стекла и в таком виде идет на заливку в парафин. Для того чтобы агар лучше был заметен в парафине, что нужно для правильной ориентировки при резании на микротоме, его можно подкрасить разведенным гематоксилином Делафильда. При дальнейшей обработке срезов эту подкраску можно удалить квасцами и т. п., но обычно она не мешает.

Окраска микротомных срезов

Окраска микротомных срезов, преследующая в первую очередь цель выявления клеточных ядер, производится всеми теми способами, какие вообще употребляются в микроскопической технике. Наиболее излюбленными здесь являются железо-гематоксилин по Heidenhain и тройная окраска по Flemming. В последней Orange лучше употреблять не в водном растворе, а в гвоздичном масле. Также его можно заменить Kongokorinth (также в гвоздичном масле). Последняя краска предпочтительнее, так как лучше выявляет стенки грибных клеток. По нашему опыту, кроме названных, хорошей и быстрой окраской для грибов является смесь фуксина с йодной зеленью, или метиленовой зеленью, или анилиновой синькой (Fuchsin-Iodgrtin, Fuchsin Methylengrun, Fuchsin-Anilinblau) с последующей диференцировкой подкисленным спиртовым раствором иода. Такие же хорошие результаты дает рекомендуемая особенно Maire последовательная окраска сначала фуксином (Diamantfuchsin) и потом Methylviolett, или Toluidinblau, или Lichtgrun. Подробности применения названных и других окрасок (время окраски, диференцировка и т. д.) различны в зависимости от объекта и способа его фиксации, поэтому их всегда приходится устанавливать опытным путем. О технике окрасок, рецептах и т. д. см. в любом руководстве микроскопической техники, например Schneider-Zimmermann, Das botanische Mikrotechnik, 1922.

Следует добавить еще одно указание: ядерные окраски, особенно анилиновыми красками, лучше в общем удаются после хромовых фиксаторов. По нашему опыту особенно хорошие результаты получаются, если наклеенные и освобожденные от парафина срезы перед окраской выдержать 24 часа в 1% растворе хромовой кислоты (лучше старого побуревшего раствора). Такая обработка полезна как после хромовых, так и после иных фиксаторов.

Окраску ядер не на микротомных срезах, а на мицелии или грубых срезах от руки, вообще, когда большая часть клеток не вскрыта, всего лучше производить гематоксилином Delafield или Ehrlich. При этом можно пользоваться как крепкими основными растворами, так и, особенно для Delafield, сильно разбавленными водопроводной водой (в 1000 раз и больше). Окраска в разбавленных растворах идет очень медленно, но диференцированно. Также хорошие результаты получаются иногда при действии очень слабых растворов анилиновой или метиленовой синьки, а также Toluidinblau в воде. Срезы от руки, кроме того, недурно красятся и обычными методами, особенно такими, как Fuchsin-Jodgrun и др. ускоренные способы.

Окраска на иные составные части клетки и включения, например хондриозомы, имеет свою методику, не отличающуюся от той, какая применяется и в других группах растений.

Прижизненная окраска

До сих пор мы имели в виду только те окраски, которые производятся после предварительной фиксации, однако возможна и прижизненная окраска. Наиболее употребительной краской здесь является Neutralrot. Он применяется в первую очередь для окраски вакуолей и выявляет их там, где в неокрашенном виде они не заметны (например мелкие вакуоли в виде канальцев в кончиках гиф сапролегниевых). Кроме того, Neutralrot как изменяющий свою окраску индикатор позволяет судить о реакции клеточного содержимого. В некоторых случаях он может применяться даже для диагностических целей, например, по отношению к нему резко различается мицелий Merulius от других разрушителей древесины, как Pоria и др.: Merulius быстро и интенсивно красится, a Poria и др. не красятся. Слабый раствор Neutralrot может служить также, чтобы отличить живые клетки от мертвых. В первых окрашиваются только вакуоли, а вторые обнаруживают сплошную окраску. Прижизненная окраска ядер удается иногда в мицелии всего лучше при действии очень разведенного раствора Toluidinblau.

Вообще методика прижизненных окрасок сейчас только-что разрабатывается, но она обещает дать важные результаты не только для морфологии грибной клетки, но и для ее физиологии как выяснение реакции клеточного содержимого, его восстановительного состояния и др.

Методы инфекции. Представители Uredinales, Erysiphaceae и некоторые другие, как известно, до сих пор не поддаются попыткам выращивания в сапрофитных условиях; их можно культивировать только на соответственных живых растениях. Такая же культура применяется нередко и для тех паразитных форм, которые могут расти и сапрофитно, например для испытания способности заражать то или иное растение. Методика такого рода культуры сводится главным образом к методике инфекции и очень мало затрагивает дальнейшее выращивание гриба, так как предоставляемая ему среда в виде живой ткани соответственного растения слишком сложна, чтобы за немногими исключениями можно было более или менее планомерно видоизменять ее. Методы инфекции для разных грибов в подробностях могут быть весьма не одинаковы, что зависит от их биологических особенностей. Поэтому здесь можно указать только несколько более общих приемов, отсылая за дальнейшими подробностями к более специальной литературе. Здесь можно указать, например, на очень полезное руководство Klebahn — Methoden der Pilzinfektion (из Abderhalden, Biologische Arbeitsmethoden). Это руководство переведено — на русский язык и выпущено под мало соответствующим его содержанию заглавием: «Диагностика грибных заболеваний». ГИЗ, 1926 г.

Инфекционное начало, почти исключительно в виде спор, наносится преимущественно на поверхность листьев и других органов соответственных растений. Иногда практикуется инфекция через поранения: например, для многих паразитов древесных стволов, которые в природе имеют такой способ заражения (так называемые, паразиты ран из Polyporaceae и др.). Еще более специальным способом является прививка кусочка ткани, содержащей мицелий гриба, к здоровому растению (например для ржавчинников, как Uromyces pisi на молочае и многих других, вызывающих так называемое диффузное заражение растения). Споровый материал для инфекции берется или из культуры, если таковая имеется, или чаще прямо с места естественного образования. Пропагативные споры, могущие немедленно прорастать, тотчас же пригодны для инфекции, что же касается покоящихся спор, то они большею частью используются только на другой год после зимовки, проведенной обыкновенно в условиях, более или менее приближающихся к естественным. Обыкновенно пораженные части растения, содержащие такие споры, помещаются в марлевом мешочке или в цветочном горшке и т. п. и выставляются под открытым небом для действия атмосферных влияний. Уже ранней весной находящиеся на них споры оказываются способными к прорастанию. Споровый материал можно затем высушить и хранить в сухом не жарком помещении до надобности. После увлажнения он обыкновенно очень скоро начинает «прорастать, развивая, как это типично для большинства покоящихся спор, сразу новые спороношения (см. стр. «Прорастание спор»). Сходные условия зимовки требуются для тех многочисленных паразитных пиреномицетов и др., которые развивают на живых листьях только конидиальные спороношения, а сумчатые образуют только на отмерших и перезимовавших листьях.

Самое нанесение заразного начала производится или опрыскиванием заражаемых растений водой, содержащей споры, или просто обсыпанием спорами. Очень удобно при этом воспользоваться естественным отделением их, поместив для этого образующий споры субстрат на заражаемом растении. Что касается самого заражаемого растения, то здесь обыкновенно пользуются маленькими горшечными экземплярами, выдержанными предварительно для испытания на отсутствие у них самостоятельного заражения. Эти горшечные экземпляры растений помещаются под стеклянными колпаками, где и заражаются указанным способом. После этого они остаются еще несколько дней под колпаками, чтобы создать атмосферу высокой влажности, благоприятную для прорастания нанесенных спор. Что касается состояния самих растений, благоприятствующих инфекции и дальнейшему развитию гриба, то для строгих паразитов, как Uredinales, здесь предпочтительнее хорошо упитанные и развитые экземпляры тогда как для некоторых, других заражение идет лучше на ослабленных растениях (для так называемых Schwacheparasiten, как виды Fusarium на злаках, некоторые Botrytis и др.). Далее, можно отметить еще, что для многих паразитов древесных стволов существенным является степень насыщения древесины водой. Для многих, как например Ceratostomella и др., обычное насыщение заболони живого дерева является слишком высоким, а заражение удается хорошо лишь в том случае, если понизить тем или иным способом содержание воды (соответственно повысив содержание воздуха) (Munch, 1909).

В случае почвенных паразитов, которые инфицируют растение через его подземные части (например многие головневые, Fusarium, Plasmodiophora), почва для выращивания опытных растений предварительно стерилизуется нагреванием, и затем в нее в нужный момент вносятся споры соответственного гриба.

Среды определённого состава

Особенностью первой среды, выработанной специально для Sterigmatocystis, но превосходной и для многих других плесеней, является специальная добавка солей железа и особенно цинка, которые в малых дозах действуют стимулирующим образом на рост.

Среды неопределенного состава

В обычной микологической практике особенно часто употребляются питательные среды неопределенного состава, в виде различных экстрактов, изготовляемых или кипячением, или настаиванием на холоде с водой, или, наконец, отжиманием различных, преимущественно растительных, тканей.

Наиболее употребительными из такого рода сред являются следующие:

1. Пивное сусло, т. е. приготовленный горячим способом водный экстракт из ячменного солода. Получается обыкновенно прямо с пивоваренного завода и употребляется или в цельном виде, или разбавленным (до 8°С и ниже по Воme).
2. Мальцэкстракт (сгущенная вытяжка солода). Растворяется в воде большей частью в количестве 2—5%. Сюда нередко добавляется еще 1% либиховского мясного экстракта.
3. Экстракт чернослива (на 1 л воды 100—200 г мякоти чернослива).
4. Экстракт конского навоза (на 1 л воды берется 250—300 г свежего навоза).
5. Экстракт картофеля (на 1 л воды 300 г картофеля, пропущенного через мясорубку).
6. Экстракт овсяной муки (на 1 л воды 50—100 г муки).
7. Экстракт кукурузной муки (на 1 л воды до 500 г муки).
8. Экстракт семян гороха или бобов (100 г семян кипятятся в 1 л воды, или, для получения более тощей среды, 2 горошины на 100 куб. см. воды).

Кроме того, особенно в качестве предварительной, разведочной культуры, часто применяется экстракт того естественного субстрата, на котором гриб найден в природе (соответственных частей того или иного растения и т. д.). Большинство указанных сред (кроме № 1, 2, 3) довольно бедны питательными веществами, поэтому к ним часто прибавляют еще несколько процентов сахара или соответственное количество какой-нибудь из сред большего питательного значения (например к экстракту конского навоза — пивное сусло; получается превосходная питательная среда для развития очень большого количества грибов, особенно копрофильных).

Культура грибов в жидких питательных средах большею частью удается хуже главным образом потому, что мицелий при этом погружается на дно и там развивается ненормально. Поэтому указанные выше и другие им подобные среды обычно желатинируют, или агаризируют (желатины 10%, агар-агара 1—2%). Также нередко применяются опилки, фильтровальная бумага и т. п., пропитанные соответствующими питательными жидкостями.

Естественные среды

Из естественных твердых сред большое употребление имеют кусочки картофеля, моркови и других овощей; далее, зерна пшеницы, риса и других злаков; хлеб, стебли травянистых, особенно бобовых растений (Melilotus и др.) и т. п. Из сред особо высокого питательного значения, пригодных для культуры и многих паразитных форм, можно еще указать: кашицу из моркови, смешанную с равным объемом сырых яиц или с половиной объема молока (среда Raimond и Billard). При употреблении в качестве питательных сред зерен, хлеба и т. п. их нужно, конечно, соответственным образом увлажнить. Однако это увлажнение не должно быть чрезмерным, чтобы субстрат при дальнейшей стерилизации не потерял своего пористого строения. При этих условиях мицелий гриба может расти в глубине его, а кроме того, например, при часто практикуемой культуре на зернах злаков в пробирках, известный недостаток воды в верхних слоях часто оказывается благоприятствующим для развития там спороношений, тогда как в более увлажненных нижних слоях обильнее идет вегетативный рост гриба.

На естественных средах так же, как на искусственных, но с содержанием различных вытяжек (среды неопределенного состава), развитие многих грибов происходит значительно лучше, чем на чистых синтетических средах. Это объясняется главным образом наличием в первых стимулирующих веществ типа биоса (стр. «Зависимость диссимиляции от окисления»). Такое же значение имеет часто прибавление к искусственной среде почвенного экстракта.

Реакция питательной среды для большинства грибов предпочтительнее кислая, какая и имеется в большинстве вышеприведенных примеров. Только экстракт конского навоза большей частью бывает слабо щелочным, что исправляется соответствующим подкислением (при желатинировании навозного экстракта специального подкисления не нужно, ввиду значительной кислотности самой желатины). Лишь в немногих случаях предпочтительнее слабо щелочная среда.

Ввиду большого значения во многих случаях реакции среды для развития гриба, для уточнения работы рекомендуется определить ее активную кислотность (рН). Это может быть произведено электрометрическим методом с водородным или хингидронным электродом (с последним только в кислых интервалах рН, которые и нужны обыкновенно для грибов) или при помощи красочных индикаторов (колориметрически). Нужно иметь ввиду, что возможно смещение рН при стерилизации, поэтому следует в отдельной пробе проверить этот показатель и после стерилизации. Еще большее смещение рН среды может происходить при дальнейшем развитии в ней гриба, причем направление (в кислую или щелочную сторону) и размеры его могут зависеть как от свойств гриба, так и от состава среды (стр. «Азотистое питание»). Если желательно избежать такого смещения, то к среде прибавляются буфферы в виде соответственных смесей безвредных солей. Чаще всего применяют для этого смеси одно- и двузамещенного фосфатов калия или натрия (от рН 9 до рН 5,3) или смеси цитрата натрия с соляной кислотой (от рН 5 до рН 2).

Подробности определения рН и применения буфферных смесей здесь не могут рассматриваться. Эти указания можно найти в специальных руководствах Вальтера, Лемана, Домонтовича и др., а также у Наумова (1937).

Само собой разумеется, что все среды стерилизуются; при этом часто бывает целесообразнее повторная стерилизация в аппарате Коха, чем автоклав. Особенно это имеет значение для желатинированных сред (в автоклаве происходит пептонизация желатины, и среда не застывает потом), а также для зерен и хлеба, так как в автоклаве они слишком развариваются и теряют свою пористую структуру.

Изолирование в чистую культуру

Метод чистых культур введен в науку впервые именно для изучения грибов Брефельдом почти 60 лет тому назад. В настоящее время чистая культура является необходимым элементом очень многих микологических работ по крайней мере с такими формами, которые вообще удается культивировать (т. е. не с облигатными паразитами). Правда, имеются указания на преимущества так называемых смешанных культур, т. е. культуры определенного гриба вместе с бактериями (например для некоторых Ascobolaceae). По существу здесь имеют значение не самое присутствие бактерий, а те изменения, какие они вносят в субстрат (см. стр. «Совместная культура с другими микроорганизмами»).

Способы изолирования

При изолировании того или иного гриба большею частью исходят от спор его (также оидий, почкующихся клеток и т. п.). При этом для получения соответственного материала всего лучше воспользоваться естественным отделением спор от производящих их органов. Так, у гименомицетов можно получить весьма чистый и однородный по степени зрелости споровый материал— если поместить на некоторое время под плодовым телом стерилизованные стекла (всего лучше кусочки покровных стекол). От многих аскомицетов, «стреляющих» своими спорами, их можно получить, поместив на небольших подставочках (например на обожженных спичках) стериллизованные покровные стекла над плодовыми телами. В других случаях, как, например, у обычных плесеней из родов Aspergillus или Penicillium, споры приходится просто захватывать платиновой иглой. Однако и здесь обычно удается уже сразу получить достаточно однородный и чистый материал. У таких форм, как Мuсоr и близкие к нему, эта гарантия чистоты увеличивается еще тем, что здесь обычно удается захватить споры только с одного желаемого спорангия. Тем или иным способом полученный споровый материал (вместе со стеклами, если он собран на них) переносится в пробирку со стерильной водой и там тщательно разбалтывается (если споры очень плотно приклеились к стеклам, то следует предварительно выдержать их 10—15 минут в воде). Затем капли воды из пробирки контролируются под микроскопом на содержание в них спор. В большинстве случаев это возможно при слабом увеличении, не накрывая каплю покровным стеклом. Желательно получить такое разведение, чтобы на каплю, захваченную платиновым ушком, приходилось не более пяти спор. Если спор слишком много, то разведение увеличивают прибавлением новой стерильной воды в пробирку; если их слишком мало, добавляют еще спорового материала. Затем одну или несколько капель достаточно разведенного материала переносят в другую пробирку с расплавленной питательной желатиной, перемешивают там и выливают в чашку Петри. Если работают с агаризированными средами, у которых настолько высокая температура застывания, что некоторые особенно нежные споры могут пострадать от нее, то среду просто выливают в чашки Петри и после застывания наносят на нее споровый материал штрихами, проводимыми платиновым ушком. Выросшие из отдельных спор мицелии затем пересеваются в пробирки.

Получение односпоровых культур

В последнее время приобрели большое значение, особенно в связи с вопросами о гомо- и гетероталлизме, изменчивости и др., точно проверенные односпоровые культуры, т. е. выращенные гарантированно из одной споры. Эта гарантия получается таким образом, что развитие культуры все время контролируется под микроскопом. При этом поступают следующим образом: добиваются такого разведения спорового материала в пробирке, чтобы в капле, захваченной платиновым ушком, была в среднем только одна спора. Затем такие капли наносят на нижнюю поверхность покровного стекла влажной камеры (висячие капли) и, просмотрев их под микроскопом, отмечают те из них, которые действительно содержат одну спору. Когда из такой споры начнет развиваться мицелий, то его захватывают вместе со средой платиновой иглой и пересевают в отдельную пробирку. Таким же образом вместо влажной камеры односпоровые капли можно нанести на поверхность питательной желатины, налитой тонким слоем в чашку Петри. Так как споры грибов обычно достаточно крупны и часто окрашены, то их можно различать при слабых системах, просматривая под микроскопом чашку в перевернутом состоянии (конечно, не открывая ее). Подходящие капли отмечаются, и мицелий, выросший на их месте, выковыривается платиновой иглой вместе с кусочком субстрата.

Для тех же целей изучения распределения полов и др. бывает желательно получить односпоровые культуры из всех спор одной сумки или базидии. Для «стреляющих» аскомицетов это сравнительно легко, так как в большинстве случаев здесь споры выбрасываются сразу. Над плодовым телом, в подходящей стадии развития помещается покровное стекло, которое через короткое время снимается и просматривается под микроскопом, а на его место ставится новое и т. д. При этом можно найти такое стекло, на которое прилип в виде кучки из 8 спор «заряд» только одной сумки. Это стекло помещается в коническую колбу с расплавленной питательной желатиной и там очень тщательно и продолжительно разбалтывается. Затем желатину охлаждают, все время повертывая колбу около продольной оси, так что получают так называемую «крученую культуру» (Rollkultur), где желатина распределена тонким слоем главным образом на боковых стенках колбы. Из спор через некоторое время вырастают мицелии; число их должно быть равно 8. Если это удалось, то мы несомненно имеем односпоровые мицелии, которые и отсеиваются в отдельные сосуды. У базидиомицетов изолирование таким же способом всех спор с одной базидии возможно только в тех сравнительно немногих случаях, где они сбрасываются одновременно (например у Aleurodiscus). Однако у большинства форм наблюдается последовательное сбрасывание базидиоспор с базидии. Здесь изолирование возможно при помощи микроманипулятора. При помощи этого же прибора некоторым авторам удалось выполнить и более сложную задачу: изолировать споры из сумки или с базидии в том порядке, в каком они расположены там (Dodge, 1929 и Wilcox, 1928 — у Neurospora; Hanna, 1929 — у Ustilago maydis).

Захватывание определенных спор, контролируемое под микроскопом, производится чаще всего тонкой сухой иглой (метод сухой иглы), к которой спора, сидящая на спороносце, легко прилипает. Понятно, что это легче делать с экзогенными спорами, чем с эндогенными. Наиболее удобный материал для иглы — тонкая стеклянная нить, которая отламывается затем вместе с прилипшей спорой и забрасывается в питательную среду. При известной ловкости такие манипуляции, как захватывание одной споры, удаются и без манипулятора, особенно, если спора сравнительно крупная. Конечно, все это можно делать только под микроскопом.

Для того чтобы следить за последовательными стадиями развития под микроскопом, употребляются культуры в висячих каплях во влажных камерах. Наиболее обычным типом их здесь являются камеры из низких стеклянных колец, примазываемых вазелином к предметному и покровному стеклам (камеры ван Тигема). На дно их наливается вода для увлажнения атмосферы камеры, а на нижнюю поверхность покровного стекла наносится возможно более плоская капля питательной среды, в которую и помещается исследуемый материал.

Камера должна быть не очень мала для того, чтобы в ней было достаточно воздуха, а сама капля должна быть достаточно широкой, чтобы грибу было достаточно места для роста. Более мелкие формы нередко удается довести до конца их цикла развития в таких камерах.

В ряде случаев, когда спор не имеется или они не прорастают, изолирование гриба в чистую культуру удается произвести, исходя из мицелия или ткани плодового тела. Например, сапролегниевые легко выделяются, если кусочек их мицелия поместить в чашку Петри на питательной желатине с пептоном. Гифы гриба при этом начинают очень быстро расти по радиусам от места инфекции, так что кончики их вскоре оказываются в зоне, свободной от бактерий и других микроорганизмов. Эти кончики затем отрезаются вместе с субстратам и переносятся на новую среду. После двух-трех таких же пересевов в чашках Петри удается получить абсолютно чистую культуру. Такой же прием удается и у многих других грибов с быстрым ростом мицелия. Из склероция чистая культура обычно легко получается, если стерилизовать его с поверхности погружением на несколько минут в спирт, формалин, раствор сулемы и т. п. и, промыв затем в стерильной воде, вырезать кусочек внутренней ткани. Положенная на питательную среду она дает рост; обыкновенно сразу уже свободный от каких-нибудь посторонних организмов. Таким же образом можно изолировать кусочки внутренней ткани из сочных плодовых тел (без предварительной их стерилизации, или слегка стерилизуя кратковременным опусканием в спирт и обжиганием). Этим способом можно получить чистые культуры таких грибов, как виды Boletus, споры которых до сих пор прорастить не удалось.

Меры предосторожности от засорения культур

При работе с чистыми культурами грибов необходимо строго соблюдать некоторые предосторожности, чтобы избежать иначе очень нередкого их дальнейшего засорения:

1. Засоренные или вообще уничтожаемые культуры должны обязательно предварительно убиваться или нагреванием их в кипящей воде, или, проще, прибавлением к ним нескольких капель формалина, причем в последнем случае чистить посуду рекомендуется только на следующий день. Без указанных мер предосторожности, при чистке культуры ее живые споры разлетаются и заражают всю атмосферу рабочего помещения.
2. При всех манипуляциях с чистыми культурами, как разливка в чашки, пересевы и т. п., рекомендуется пользоваться перевивочными шкафиками, внутреннюю поверхность которых нужно стерилизовать формалином, спиртом и т. п. или смазать глицерином с сулемой.