Микроскопическое исследование грибов в основе представляет мало особенностей по сравнению с другими растительными объектами. Культуры на прозрачной среде, налитой тонким слоем в чашках Петри, могут прямо просматриваться под микроскопом при слабом увеличении. Еще удобнее вырезать кусочек среды вместе с грибом и рассматривать его на предметном стекле. Если нужен боковой вид, то его можно легко получить, отрезав соответственный узкий ломоть среды и положив на стекло боком. При этих условиях большая часть органов размножения рассматривается непосредственно на месте их образования в воздушной среде. Это имеет и преимущества, так как при этом конидиеносцы и т. п. сохраняют свой естественный вид и споры, но вместе с тем и известные недостатки, так как заставляет пользоваться только слабым увеличением, а самое изображение объекта, находящееся в воздухе, много теряет в своей ясности. При более сильных увеличениях, когда необходимо покровное стекло, рекомендуется помещать объект не в воду, а в крепкую уксусную кислоту, которая прекрасно смачивает его (например трудно смачиваемые, иначе, конидиеносцы с конидиями) и удаляет из него воздух. Вместе с тем уксусная кислота значительно меньше деформирует объект и не вызывает отпадения конидий, чем выгодно отличается от часто употребляемого также для этих целей спирта. Если гриб находится на непрозрачном субстрате или сам он слишком массивен и поэтому непрозрачен, то, конечно, необходимы срезы, которые затем в случае нужды могут просветляться (едким кали, лактофенолом и т. д.). В других случаях хорошие результаты дает просто соскабливание с поверхности субстрата. При изучении мелких сочных плодовых тел очень хорошие результаты нередко дают раздавленные препараты: все плодовое тело или, лучше, толстоватый ломтик, вырезанный из его середины, раздавливается в капле воды между предметным и покровным стеклами. Таким образом, например, у Ascobolaceae легко удается получить хорошие картины аскогенных гиф с сидящими на них асками на разных стадиях развития. Если раздавливание произвести в капле фиксирующей жидкости, то препарат затем можно пустить и на окраску ядер, например гематоксином Делафильда (промывать не снимая покровного стекла). Постоянные препараты, сделанные таким простым способом, лучше заключать в глицерин, так как при перенесении в канадский бальзам они слишком деформируются, а неокрашенные, кроме того, делаются слишком прозрачными до исчезновения некоторых контуров.
Contents
Способы диференцированной окраски
Для изучения прохождения гиф паразита в ткани питающего растения предложено несколько иногда довольно сложных способов диференцированной окраски их. По нашему опыту очень хорошие результаты дает следующий метод: срезы от руки опускаются на несколько минут в спирт (если изучается не фиксированный материал), и затем после ополаскивания в воде помещаются в раствор следующего состава: Anilinblau (0,1% водный раствор) — 1 часть и молочная кислота — 1 часть. В нем срезы нагреваются на предметном стекле несколько минут до парообразования. Затем после удаления краски они диференцируются при нагревании в одной молочной кислоте. Получаются яркоголубые гифы на бесцветном фоне ткани хозяина. Препараты, изготовленные таким образом, могут сохраняться, не теряя окраски, в молочной кислоте несколько дней и даже недель; если же, удалив молочную кислоту, заключить их в глицерин или бальзам, то получаются постоянные препараты.
Для целей более тонкого цитологического исследования необходима, конечно, более сложная методика. Прежде всего фиксация. Общие правила ее таковы:
- Фиксируемый материал должен быть свежим и тургесцентным. Если берется материал из природы, то его лучше фиксировать на месте, или, принеся домой, поставить на ночь в условия большой влажности (например ветви или листья с паразитными грибами опустить черешками в воду и все накрыть стеклянным колпаком). То же нужно делать при сборе материала в жаркую засушливую погоду или во время значительных понижений температуры. В теплом и влажном помещении в комнате не только восстанавливается туpгop, но и возобновляются митозы, которые при неблагоприятных условиях прекращаются. Дневные и ночные фиксации по нашим наблюдениям в общем не отличаются по обилию ядерных делений.
- Фиксирующая жидкость должна быстро проникать в фиксируемый материал; для этого вообще нужно фиксировать небольшие кусочки (несколько миллиметров). Если фиксируются листья, особенно водными жидкостями, плохо смачивающими их эпидермис, то из них вырезаются кусочки, содержащие гриб, и жидкость проникает в ткань через разрезы листовой сочной мякоти (кусочки следует потопить, например, металлической пропарафиненной селкой). Иногда для особо трудно смачиваемых объектов хорошо погрузить их сначала на несколько секунд в 70% спирт и из него уже перенести в водную фиксирующую жидкость. Прониканию жидкости внутрь объекта очень помогает фиксация при пониженном давлении под колоколом насоса (существенное преимущество фиксации в лаборатории перед фиксацией на месте сбора). При этом объекты, плавающие на поверхности жидкости, следует потопить. Когда из них при уменьшении давления выйдут пузырьки воздуха, кран колокола слегка приоткрывается и повышающееся давление загоняет фиксирующую жидкость внутрь объекта. Фиксация культур под насосом производится таким же образом вместе с вырезанными кусочками питательной среды (агар может затем заливаться в парафин, а желатину необходимо отмыть перед заливкой теплой водой, причем после хромовых фиксаций отмывание идет плохо).
Фиксирующие жидкости
Наиболее употребительные в микологической практике фиксирующие жидкости делятся на две основные категории: спиртовые и водные. Преимущество первых в том, что они хорошо смачивают объект и быстро в него проникают, с другой стороны, они часто вызывают значительные деформации и сжимания, особенно клеток с большими вакуолями. Водные жидкости хуже смачивают и проникают, но их действие на клетки более нежное и постепенное; поэтому таких деформаций они обыкновенно не дают.
Спиртовые жидкости:
1) Жидкость Саrnоу имеется в нескольких видоизменениях:
а) Абсолютного спирта — 3 части, Ледяной уксусной кислоты — 1 часть;
b) Абсолютного спират 6 частей, Ледяной уксусной кислоты — 1 часть, Хлороформа — 3 части;
с) Видоизменение Maire: Абсолютного спират — 1 часть, Уксусной кислоты — 1 часть, Хлороформа — 1 часть, Сулеймы — до насыщения.
Все преимущества и недостатки спиртовых жидкостей выражены здесь наиболее резко. В общем хорошая фиксация ядер, особенно в клетках с обильной протоплазмой. Прибавление сулемы (по рецепту Мэра) способствует, по нашим наблюдениям, более четким окраскам ядер и их митозов.
2) Жидкость Juel:
Хлористого цинка — 2г
50% спирта — 100 куб. см
Уксусной кислоты — 2 куб. см
Меньше сжимает, чем жидкость Саrnоу, но фиксация ядер часто менее четкая.
3) Жидкость Schaudinn:
Абсолютного спирта — 100 куб. см
Насыщенного водного раствора сулеймы — 200 куб. см
Уксусной кислоты — 2 куб. см
4) Спирт абсолютный, или 96°, или спирт с формалином состава: 70% спирта 94—98 частей + формалина 6—2 части. Пригодны преимущественно для анатомических целей, а крепкий чистый спирт также и для цитологических, хотя клетки с значительными вакуолями им сильно сжимаются. Преимущество этих жидкостей в том, что объекты в них могут и сохраняться (для длительных экскурсий).
Водные жидкости:
5) Жидкость Flemming. Чаще употребляют так называемую слабую смесь.
1% хромовой кислоты — 180 куб. см
2% осмиевой кислоты — 25 куб. см
Уксусной кислоты — 12 куб. см
Дестиллированной воды — 210 куб. см
Осмиеву кислоту можно также прибавлять не в растворе, а в кристаллах, делая по ее количеству расчет всех других ингредиентов. Классическая фиксирующая жидкость, превосходно фиксирующая ядра. Недостаток — медленное проникание, поэтому рекомендуется особенно для мелких объектов или хорошо смачиваемых (например кусочков сочных плодовых тел).
6) Видоизменение Навашина с заменой осмиевой кислоты формалином.
1% хромовой кислоты — 15 куб. см
Формалина — 2 куб. см
Уксусной кислоты — 1 куб. см
Дестиллированной воды — 17 куб. см
Формалин прибавляется перед употреблением. На высших растениях дает очень хорошие результаты. По нашему небольшому опыту работы с этой жидкостью для некоторых грибов она также пригодна, хотя в общем значительно хуже Флемминга.
7) Жидкость Merkel.
1% хромовой кислоты — 1 часть
1% хлористой платины — 1 часть
Дестиллированной воды — 1 часть
Приближается по характеру фиксации к Флеммингу, но не чернит объекта. Рекомендуется особенно для молодых стадий развития: аскогоны и т. п.
8) Хромово-уксусная кислота:
Хромового ангидрида — 7г
Уксусной кислоты — 3г
Воды — 100 куб. см
Особенно для водных форм (сапролегниевые и другие), где дает превосходную фиксацию.
9) Пикрсформол:
Формалин (40%) — 6 частей
Вода — 4 части
Уксусная кислота — 1 часть
Прибавляется до насыщения пикриновой кислоты.
Пикроформол особенно рекомендуется Maire для гименомицетов. По нашему опыту с Uredinales и некоторыми аскомицетами фиксация ядер получается не вполне удовлетворительная.
10) Сулема с уксусной кислотой:
Сулема — 10 г
Уксусная кислота — 3 куб. см
Вода — 300 куб. см
Кроме указанного, существует еще много рецептов водных сулемовых фиксаторов (жидкость Ценкера и др.). Все они имеют более или менее одинаковые достоинства. Фиксация ядер четкая. По нашим наблюдениям сулема (также и в комбинации Schaudinn) дает хорошие результаты у Ustilaginales (прорастание хламидоспор, споридии и т. д.).
Кроме перечисленных, употребляются еще иногда и другие фиксаторы, перечислять которые здесь не нужно. Вообще следует сказать, что выбор фиксатора зависит в первую очередь от объекта, и при работе с незнакомым объектом приходится обыкновенно фиксировать его параллельно несколькими методами.
Продолжительность фиксации зависит от фиксатора и от объекта, чаще всего 12—24 часа. После фиксации фиксирующая жидкость отмывается тщательно водой (для сулемовых фиксаторов — водой или разведенным спиртом с добавкой йода до цвета белого вина). Затем объекты сохраняются в 70% спирту, куда переносятся из воды через 2—3 степени более слабых разведений спирта.
Дальнейшая обработка фиксированного материала: обезвоживание, заключение в парафин и т. д. производится по обычным правилам микроскопической техники, поэтому здесь на этом можно совсем не останавливаться. Можно отметить только, что объекты, зафиксированные с агаром, с ним вместе заливаются в парафин и режутся на микротоме. Это представляет даже значительное преимущество для ориентировки мелких объектов, например, зачатков плодовых тел, или конидиеносцев, которые сидят обыкновенно перпендикулярно к поверхности питательного агара. Способность агара резаться на микротоме используется и для заливки очень мелких свободных объектов. Они помещаются на поверхности плоской застывшей капли 2% агара, на предметном стекле, расправляются и ориентируются там под лупой и затем накрываются второй каплей растопленного агара или лепешечкой уже застывшего (избегать пузырьков воздуха). В последнем случае затем горячей иглой по краям обе лепешечки сплавляются. Затем все снимается со стекла и в таком виде идет на заливку в парафин. Для того чтобы агар лучше был заметен в парафине, что нужно для правильной ориентировки при резании на микротоме, его можно подкрасить разведенным гематоксилином Делафильда. При дальнейшей обработке срезов эту подкраску можно удалить квасцами и т. п., но обычно она не мешает.
Окраска микротомных срезов
Окраска микротомных срезов, преследующая в первую очередь цель выявления клеточных ядер, производится всеми теми способами, какие вообще употребляются в микроскопической технике. Наиболее излюбленными здесь являются железо-гематоксилин по Heidenhain и тройная окраска по Flemming. В последней Orange лучше употреблять не в водном растворе, а в гвоздичном масле. Также его можно заменить Kongokorinth (также в гвоздичном масле). Последняя краска предпочтительнее, так как лучше выявляет стенки грибных клеток. По нашему опыту, кроме названных, хорошей и быстрой окраской для грибов является смесь фуксина с йодной зеленью, или метиленовой зеленью, или анилиновой синькой (Fuchsin-Iodgrtin, Fuchsin Methylengrun, Fuchsin-Anilinblau) с последующей диференцировкой подкисленным спиртовым раствором иода. Такие же хорошие результаты дает рекомендуемая особенно Maire последовательная окраска сначала фуксином (Diamantfuchsin) и потом Methylviolett, или Toluidinblau, или Lichtgrun. Подробности применения названных и других окрасок (время окраски, диференцировка и т. д.) различны в зависимости от объекта и способа его фиксации, поэтому их всегда приходится устанавливать опытным путем. О технике окрасок, рецептах и т. д. см. в любом руководстве микроскопической техники, например Schneider-Zimmermann, Das botanische Mikrotechnik, 1922.
Следует добавить еще одно указание: ядерные окраски, особенно анилиновыми красками, лучше в общем удаются после хромовых фиксаторов. По нашему опыту особенно хорошие результаты получаются, если наклеенные и освобожденные от парафина срезы перед окраской выдержать 24 часа в 1% растворе хромовой кислоты (лучше старого побуревшего раствора). Такая обработка полезна как после хромовых, так и после иных фиксаторов.
Окраску ядер не на микротомных срезах, а на мицелии или грубых срезах от руки, вообще, когда большая часть клеток не вскрыта, всего лучше производить гематоксилином Delafield или Ehrlich. При этом можно пользоваться как крепкими основными растворами, так и, особенно для Delafield, сильно разбавленными водопроводной водой (в 1000 раз и больше). Окраска в разбавленных растворах идет очень медленно, но диференцированно. Также хорошие результаты получаются иногда при действии очень слабых растворов анилиновой или метиленовой синьки, а также Toluidinblau в воде. Срезы от руки, кроме того, недурно красятся и обычными методами, особенно такими, как Fuchsin-Jodgrun и др. ускоренные способы.
Окраска на иные составные части клетки и включения, например хондриозомы, имеет свою методику, не отличающуюся от той, какая применяется и в других группах растений.
Прижизненная окраска
До сих пор мы имели в виду только те окраски, которые производятся после предварительной фиксации, однако возможна и прижизненная окраска. Наиболее употребительной краской здесь является Neutralrot. Он применяется в первую очередь для окраски вакуолей и выявляет их там, где в неокрашенном виде они не заметны (например мелкие вакуоли в виде канальцев в кончиках гиф сапролегниевых). Кроме того, Neutralrot как изменяющий свою окраску индикатор позволяет судить о реакции клеточного содержимого. В некоторых случаях он может применяться даже для диагностических целей, например, по отношению к нему резко различается мицелий Merulius от других разрушителей древесины, как Pоria и др.: Merulius быстро и интенсивно красится, a Poria и др. не красятся. Слабый раствор Neutralrot может служить также, чтобы отличить живые клетки от мертвых. В первых окрашиваются только вакуоли, а вторые обнаруживают сплошную окраску. Прижизненная окраска ядер удается иногда в мицелии всего лучше при действии очень разведенного раствора Toluidinblau.
Вообще методика прижизненных окрасок сейчас только-что разрабатывается, но она обещает дать важные результаты не только для морфологии грибной клетки, но и для ее физиологии как выяснение реакции клеточного содержимого, его восстановительного состояния и др.