Состав сред

Среды определённого состава

Особенностью первой среды, выработанной специально для Sterigmatocystis, но превосходной и для многих других плесеней, является специальная добавка солей железа и особенно цинка, которые в малых дозах действуют стимулирующим образом на рост.

Среды неопределенного состава

В обычной микологической практике особенно часто употребляются питательные среды неопределенного состава, в виде различных экстрактов, изготовляемых или кипячением, или настаиванием на холоде с водой, или, наконец, отжиманием различных, преимущественно растительных, тканей.

Наиболее употребительными из такого рода сред являются следующие:

1. Пивное сусло, т. е. приготовленный горячим способом водный экстракт из ячменного солода. Получается обыкновенно прямо с пивоваренного завода и употребляется или в цельном виде, или разбавленным (до 8°С и ниже по Воme).
2. Мальцэкстракт (сгущенная вытяжка солода). Растворяется в воде большей частью в количестве 2—5%. Сюда нередко добавляется еще 1% либиховского мясного экстракта.
3. Экстракт чернослива (на 1 л воды 100—200 г мякоти чернослива).
4. Экстракт конского навоза (на 1 л воды берется 250—300 г свежего навоза).
5. Экстракт картофеля (на 1 л воды 300 г картофеля, пропущенного через мясорубку).
6. Экстракт овсяной муки (на 1 л воды 50—100 г муки).
7. Экстракт кукурузной муки (на 1 л воды до 500 г муки).
8. Экстракт семян гороха или бобов (100 г семян кипятятся в 1 л воды, или, для получения более тощей среды, 2 горошины на 100 куб. см. воды).

Кроме того, особенно в качестве предварительной, разведочной культуры, часто применяется экстракт того естественного субстрата, на котором гриб найден в природе (соответственных частей того или иного растения и т. д.). Большинство указанных сред (кроме № 1, 2, 3) довольно бедны питательными веществами, поэтому к ним часто прибавляют еще несколько процентов сахара или соответственное количество какой-нибудь из сред большего питательного значения (например к экстракту конского навоза — пивное сусло; получается превосходная питательная среда для развития очень большого количества грибов, особенно копрофильных).

Культура грибов в жидких питательных средах большею частью удается хуже главным образом потому, что мицелий при этом погружается на дно и там развивается ненормально. Поэтому указанные выше и другие им подобные среды обычно желатинируют, или агаризируют (желатины 10%, агар-агара 1—2%). Также нередко применяются опилки, фильтровальная бумага и т. п., пропитанные соответствующими питательными жидкостями.

Естественные среды

Из естественных твердых сред большое употребление имеют кусочки картофеля, моркови и других овощей; далее, зерна пшеницы, риса и других злаков; хлеб, стебли травянистых, особенно бобовых растений (Melilotus и др.) и т. п. Из сред особо высокого питательного значения, пригодных для культуры и многих паразитных форм, можно еще указать: кашицу из моркови, смешанную с равным объемом сырых яиц или с половиной объема молока (среда Raimond и Billard). При употреблении в качестве питательных сред зерен, хлеба и т. п. их нужно, конечно, соответственным образом увлажнить. Однако это увлажнение не должно быть чрезмерным, чтобы субстрат при дальнейшей стерилизации не потерял своего пористого строения. При этих условиях мицелий гриба может расти в глубине его, а кроме того, например, при часто практикуемой культуре на зернах злаков в пробирках, известный недостаток воды в верхних слоях часто оказывается благоприятствующим для развития там спороношений, тогда как в более увлажненных нижних слоях обильнее идет вегетативный рост гриба.

На естественных средах так же, как на искусственных, но с содержанием различных вытяжек (среды неопределенного состава), развитие многих грибов происходит значительно лучше, чем на чистых синтетических средах. Это объясняется главным образом наличием в первых стимулирующих веществ типа биоса (стр. «Зависимость диссимиляции от окисления»). Такое же значение имеет часто прибавление к искусственной среде почвенного экстракта.

Реакция питательной среды для большинства грибов предпочтительнее кислая, какая и имеется в большинстве вышеприведенных примеров. Только экстракт конского навоза большей частью бывает слабо щелочным, что исправляется соответствующим подкислением (при желатинировании навозного экстракта специального подкисления не нужно, ввиду значительной кислотности самой желатины). Лишь в немногих случаях предпочтительнее слабо щелочная среда.

Ввиду большого значения во многих случаях реакции среды для развития гриба, для уточнения работы рекомендуется определить ее активную кислотность (рН). Это может быть произведено электрометрическим методом с водородным или хингидронным электродом (с последним только в кислых интервалах рН, которые и нужны обыкновенно для грибов) или при помощи красочных индикаторов (колориметрически). Нужно иметь ввиду, что возможно смещение рН при стерилизации, поэтому следует в отдельной пробе проверить этот показатель и после стерилизации. Еще большее смещение рН среды может происходить при дальнейшем развитии в ней гриба, причем направление (в кислую или щелочную сторону) и размеры его могут зависеть как от свойств гриба, так и от состава среды (стр. «Азотистое питание»). Если желательно избежать такого смещения, то к среде прибавляются буфферы в виде соответственных смесей безвредных солей. Чаще всего применяют для этого смеси одно- и двузамещенного фосфатов калия или натрия (от рН 9 до рН 5,3) или смеси цитрата натрия с соляной кислотой (от рН 5 до рН 2).

Подробности определения рН и применения буфферных смесей здесь не могут рассматриваться. Эти указания можно найти в специальных руководствах Вальтера, Лемана, Домонтовича и др., а также у Наумова (1937).

Само собой разумеется, что все среды стерилизуются; при этом часто бывает целесообразнее повторная стерилизация в аппарате Коха, чем автоклав. Особенно это имеет значение для желатинированных сред (в автоклаве происходит пептонизация желатины, и среда не застывает потом), а также для зерен и хлеба, так как в автоклаве они слишком развариваются и теряют свою пористую структуру.

Изолирование в чистую культуру

Метод чистых культур введен в науку впервые именно для изучения грибов Брефельдом почти 60 лет тому назад. В настоящее время чистая культура является необходимым элементом очень многих микологических работ по крайней мере с такими формами, которые вообще удается культивировать (т. е. не с облигатными паразитами). Правда, имеются указания на преимущества так называемых смешанных культур, т. е. культуры определенного гриба вместе с бактериями (например для некоторых Ascobolaceae). По существу здесь имеют значение не самое присутствие бактерий, а те изменения, какие они вносят в субстрат (см. стр. «Совместная культура с другими микроорганизмами»).

Способы изолирования

При изолировании того или иного гриба большею частью исходят от спор его (также оидий, почкующихся клеток и т. п.). При этом для получения соответственного материала всего лучше воспользоваться естественным отделением спор от производящих их органов. Так, у гименомицетов можно получить весьма чистый и однородный по степени зрелости споровый материал— если поместить на некоторое время под плодовым телом стерилизованные стекла (всего лучше кусочки покровных стекол). От многих аскомицетов, «стреляющих» своими спорами, их можно получить, поместив на небольших подставочках (например на обожженных спичках) стериллизованные покровные стекла над плодовыми телами. В других случаях, как, например, у обычных плесеней из родов Aspergillus или Penicillium, споры приходится просто захватывать платиновой иглой. Однако и здесь обычно удается уже сразу получить достаточно однородный и чистый материал. У таких форм, как Мuсоr и близкие к нему, эта гарантия чистоты увеличивается еще тем, что здесь обычно удается захватить споры только с одного желаемого спорангия. Тем или иным способом полученный споровый материал (вместе со стеклами, если он собран на них) переносится в пробирку со стерильной водой и там тщательно разбалтывается (если споры очень плотно приклеились к стеклам, то следует предварительно выдержать их 10—15 минут в воде). Затем капли воды из пробирки контролируются под микроскопом на содержание в них спор. В большинстве случаев это возможно при слабом увеличении, не накрывая каплю покровным стеклом. Желательно получить такое разведение, чтобы на каплю, захваченную платиновым ушком, приходилось не более пяти спор. Если спор слишком много, то разведение увеличивают прибавлением новой стерильной воды в пробирку; если их слишком мало, добавляют еще спорового материала. Затем одну или несколько капель достаточно разведенного материала переносят в другую пробирку с расплавленной питательной желатиной, перемешивают там и выливают в чашку Петри. Если работают с агаризированными средами, у которых настолько высокая температура застывания, что некоторые особенно нежные споры могут пострадать от нее, то среду просто выливают в чашки Петри и после застывания наносят на нее споровый материал штрихами, проводимыми платиновым ушком. Выросшие из отдельных спор мицелии затем пересеваются в пробирки.

Получение односпоровых культур

В последнее время приобрели большое значение, особенно в связи с вопросами о гомо- и гетероталлизме, изменчивости и др., точно проверенные односпоровые культуры, т. е. выращенные гарантированно из одной споры. Эта гарантия получается таким образом, что развитие культуры все время контролируется под микроскопом. При этом поступают следующим образом: добиваются такого разведения спорового материала в пробирке, чтобы в капле, захваченной платиновым ушком, была в среднем только одна спора. Затем такие капли наносят на нижнюю поверхность покровного стекла влажной камеры (висячие капли) и, просмотрев их под микроскопом, отмечают те из них, которые действительно содержат одну спору. Когда из такой споры начнет развиваться мицелий, то его захватывают вместе со средой платиновой иглой и пересевают в отдельную пробирку. Таким же образом вместо влажной камеры односпоровые капли можно нанести на поверхность питательной желатины, налитой тонким слоем в чашку Петри. Так как споры грибов обычно достаточно крупны и часто окрашены, то их можно различать при слабых системах, просматривая под микроскопом чашку в перевернутом состоянии (конечно, не открывая ее). Подходящие капли отмечаются, и мицелий, выросший на их месте, выковыривается платиновой иглой вместе с кусочком субстрата.

Для тех же целей изучения распределения полов и др. бывает желательно получить односпоровые культуры из всех спор одной сумки или базидии. Для «стреляющих» аскомицетов это сравнительно легко, так как в большинстве случаев здесь споры выбрасываются сразу. Над плодовым телом, в подходящей стадии развития помещается покровное стекло, которое через короткое время снимается и просматривается под микроскопом, а на его место ставится новое и т. д. При этом можно найти такое стекло, на которое прилип в виде кучки из 8 спор «заряд» только одной сумки. Это стекло помещается в коническую колбу с расплавленной питательной желатиной и там очень тщательно и продолжительно разбалтывается. Затем желатину охлаждают, все время повертывая колбу около продольной оси, так что получают так называемую «крученую культуру» (Rollkultur), где желатина распределена тонким слоем главным образом на боковых стенках колбы. Из спор через некоторое время вырастают мицелии; число их должно быть равно 8. Если это удалось, то мы несомненно имеем односпоровые мицелии, которые и отсеиваются в отдельные сосуды. У базидиомицетов изолирование таким же способом всех спор с одной базидии возможно только в тех сравнительно немногих случаях, где они сбрасываются одновременно (например у Aleurodiscus). Однако у большинства форм наблюдается последовательное сбрасывание базидиоспор с базидии. Здесь изолирование возможно при помощи микроманипулятора. При помощи этого же прибора некоторым авторам удалось выполнить и более сложную задачу: изолировать споры из сумки или с базидии в том порядке, в каком они расположены там (Dodge, 1929 и Wilcox, 1928 — у Neurospora; Hanna, 1929 — у Ustilago maydis).

Захватывание определенных спор, контролируемое под микроскопом, производится чаще всего тонкой сухой иглой (метод сухой иглы), к которой спора, сидящая на спороносце, легко прилипает. Понятно, что это легче делать с экзогенными спорами, чем с эндогенными. Наиболее удобный материал для иглы — тонкая стеклянная нить, которая отламывается затем вместе с прилипшей спорой и забрасывается в питательную среду. При известной ловкости такие манипуляции, как захватывание одной споры, удаются и без манипулятора, особенно, если спора сравнительно крупная. Конечно, все это можно делать только под микроскопом.

Для того чтобы следить за последовательными стадиями развития под микроскопом, употребляются культуры в висячих каплях во влажных камерах. Наиболее обычным типом их здесь являются камеры из низких стеклянных колец, примазываемых вазелином к предметному и покровному стеклам (камеры ван Тигема). На дно их наливается вода для увлажнения атмосферы камеры, а на нижнюю поверхность покровного стекла наносится возможно более плоская капля питательной среды, в которую и помещается исследуемый материал.

Камера должна быть не очень мала для того, чтобы в ней было достаточно воздуха, а сама капля должна быть достаточно широкой, чтобы грибу было достаточно места для роста. Более мелкие формы нередко удается довести до конца их цикла развития в таких камерах.

В ряде случаев, когда спор не имеется или они не прорастают, изолирование гриба в чистую культуру удается произвести, исходя из мицелия или ткани плодового тела. Например, сапролегниевые легко выделяются, если кусочек их мицелия поместить в чашку Петри на питательной желатине с пептоном. Гифы гриба при этом начинают очень быстро расти по радиусам от места инфекции, так что кончики их вскоре оказываются в зоне, свободной от бактерий и других микроорганизмов. Эти кончики затем отрезаются вместе с субстратам и переносятся на новую среду. После двух-трех таких же пересевов в чашках Петри удается получить абсолютно чистую культуру. Такой же прием удается и у многих других грибов с быстрым ростом мицелия. Из склероция чистая культура обычно легко получается, если стерилизовать его с поверхности погружением на несколько минут в спирт, формалин, раствор сулемы и т. п. и, промыв затем в стерильной воде, вырезать кусочек внутренней ткани. Положенная на питательную среду она дает рост; обыкновенно сразу уже свободный от каких-нибудь посторонних организмов. Таким же образом можно изолировать кусочки внутренней ткани из сочных плодовых тел (без предварительной их стерилизации, или слегка стерилизуя кратковременным опусканием в спирт и обжиганием). Этим способом можно получить чистые культуры таких грибов, как виды Boletus, споры которых до сих пор прорастить не удалось.

Меры предосторожности от засорения культур

При работе с чистыми культурами грибов необходимо строго соблюдать некоторые предосторожности, чтобы избежать иначе очень нередкого их дальнейшего засорения:

1. Засоренные или вообще уничтожаемые культуры должны обязательно предварительно убиваться или нагреванием их в кипящей воде, или, проще, прибавлением к ним нескольких капель формалина, причем в последнем случае чистить посуду рекомендуется только на следующий день. Без указанных мер предосторожности, при чистке культуры ее живые споры разлетаются и заражают всю атмосферу рабочего помещения.
2. При всех манипуляциях с чистыми культурами, как разливка в чашки, пересевы и т. п., рекомендуется пользоваться перевивочными шкафиками, внутреннюю поверхность которых нужно стерилизовать формалином, спиртом и т. п. или смазать глицерином с сулемой.